Microbiome/识别邻近植物产生的氰化物使根乙烯介导根际微生物群落重组
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翻译:李祖冰，西北农林科技大学微生物学硕士研究生
题目：Root ethylene mediates rhizosphere microbial community reconstruction when chemically detecting cyanide produced by neighbouring plants
识别邻近植物产生的氰化物使根乙烯介导根际微生物群落重组
期刊：Microbiome
IF:9.365
通讯作者：孙波
摘要
背景：胁迫诱导激素是植物调节其微生物群和动态适应环境所必需的。尽管强调了植物激素乙烯在植物对异质邻居检测的生理反应中的作用，但对这种激活信号如何介导植物根际微生物群以增强植物适应性的研究还很少。本文通过3年花生和含氰木薯间作和花生单作田、盆栽和水培试验，以及外源乙烯施用和土壤培养试验，发现乙烯作为一种氰化物衍生信号，与花生生长发育有关花生根际邻近木薯的化学鉴定及微生物再组合。
结果：相邻木薯植株产生氰化物可引起花生根系产生乙烯。这种气体信号改变了花生的微生物组成，并通过改变放线菌种类Catenulispora sp.的丰度重新组合了花生的微生物共生网络，Catenulispora sp.成为间作花生根际的关键。重组后的根际微生物群为花生根系提供了更多的有效养分，有利于种子生产。
结论：根乙烯具有双重作用。它在感知来自种间邻域的生物化学信号中起作用，在调节根际微生物群落中起调节作用，从而通过提高种子产量来增强植物的适生性。这一发现为通过植物激素信号定向调控根际微生物提供了一个很有前途的方向。
模式图:木薯花生间作系统中花生介导根际微生物群增加有效养分的机理综述。地下氰化物暴露诱导花生根系产生乙烯，乙烯介导放线菌群重塑根际微生物群，通过提高有效养分含量促进花生种子生产。
实验设计
（一）田间试验
图1a田间试验间作和单作采样点示意图。
1. 田间设计
进行为期三年的田间试验，（i）PC：花生与含氰木薯间作（ii）PP花生单作(图1a)，PC区域的花生密度与PP区域的花生密度相同。
2.田间土壤和植物取样
（1）土壤采样:
①PC间作:花生根际土壤(PRi)、木薯根际土壤(CRi)、距花生和木薯根20cm的土壤(BSi);
② PP单作:花生根际土壤(PRm)和距花生根20cm的土壤(BSm)(图1a)。
（2）植物取样：
测定叶绿素含量(植株顶部的一片叶子)，株高和地上分枝，测定植物生物量。所有土壤和植物样本采集于2016年5月29日花生开花期。
花生收获后，在PP区域收集5–20cm深度处的土壤，进行盆栽试验。
（二）盆栽试验
图1b盆栽试验间作和单作采样点示意图
1.植物盆栽设计
①处理I-III：鉴定参与种间相互作用的代谢物，在花盆中央放置一个金属丝网，形成两个隔间，如图1b所示，在两个隔间分别种植对应的植物；
② 处理IV:取样24小时之前，在土壤表面喷洒CN-来确定花生对土壤氰化物浓度的激素反应；
③对照C：用蒸馏水代替溶液。
2.土壤和植物取样
移植20天后，对植物进行破坏取样。
（1）土壤取样
处理I: Cms木薯根际土壤，CBms距离木薯根20cm的土壤;
处理II: Cis木薯根际土壤; Pis花生根际土壤;和PBis，距离木薯和花生根20厘米的土壤;
处理III: Pms花生根际土壤、PBms距花生根20cm的土壤。
取根际土、距离根20cm的土壤，进行氰化物测定
（2）植物取样：
处理II: Pip间作花生;
处理III:Pmp单作花生;
处理IV: CNp氰化物处理24h后的花生;
对照：Cp对照花生
测定几类植物激素、氰化物；计算根乙烯的产量；通过RT-PCR测量根乙烯合成相关基因的表达。
（三）水培试验
图S2a水培法检测外源氰化物对花生根系乙烯产生的调节作用
为消除土壤微生物对根际乙烯生产的干扰，建立了水培培养。①含氰化物的溶液；②氰化物+ CoCl2(氯化钴，乙烯生物合成抑制剂)溶液；③蒸馏水处理。培养24 h和48 h后，取根测量乙烯产量和相关基因转录表达。
（四）土壤培养
图6a外源性乙烯加成试验。30克PRi处理的土壤被放置在消毒瓶。然后将200mL 0.1mM、0.2mM、0.5mM标准乙烯气体(乙烯与空气混合)注入玻璃瓶(V = 100mL)，完全替代空气。对照组(0mM)，注入气体用空气代替。注射后立即封管，26℃孵育7天，进行微生物群落检测。
为了进一步确定乙烯是否具有介导土壤特异菌群的潜力，对PP系统花生根际土壤进行了不同浓度乙烯的培养 (图6a)。7d后取1g土样进行16S高通量测序分析。其余的土用于测量化学性质和酶活。
结果与讨论
与木薯共培养的花生性状和根际养分特征（田间试验）
间作与单作的花生产量相似，但生物量下降，尤其是地上生物量(表1)。这种在种子产量上的投入变化与植物的进化共存策略相似；此外，与单作花生根际相比，间作花生根际土壤理化性状有所提高(补充表S1)。由于土壤微生物在根际养分释放和转化中起着核心作用，这种养分差异可能意味两个系统中微生物群落的变化。
2.邻近的氰化物会引发花生根部产生乙烯（盆栽试验）
图2土壤氰化物对乙烯根合成和释放的影响。
a.不同处理花生地上和地下组织中ACC浓度b.木薯和花生根际土壤以及相应的土壤中氰化物的浓度c.花生根中的氰化物浓度d.不同处理对花生根系乙烯(ET)产量的影响e.不同处理花生根中ACS基因(AhACS1和AhACS2)表达的qRT-PCR检测f.不同处理花生根中ACO基因(AhACO1和AhACO2)表达的qRT-PCR检测。
在间作制度下，花生个体将更多的资源分配到种子产生上，这种生理反应总是由植物激素信号来协调。监测花生地上地下激素水平，如图2a，与木薯间作会刺激花生根处（Pip）1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)的产生；外源氰化物的添加（CNp）产生类似结果(文中此处描述与图2a不一致，译者认为可能是图中组别标记错误)。前人研究表明氰化物可以诱导乙烯产生，但从未报道过参与植物-植物化学识别。
检测到木薯根际(Cis)到花生根际(Pis) 氰化物浓度呈陡坡变化，且花生根际（Pis）的氰化物含量是单作体系(Pms)的4倍(图2 b)，但花生组织中未受影响（图2c）。邻近木薯的氰化物对花生地下ACC生产有积极影响，同时ACC是乙烯(ET)的直接前体。花生根中较高的ACC对应较高的ET产量(图2d)。
为了消除土壤微生物对ET生产的干扰，采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术，追踪乙烯合成关键酶相关基因的表达。其表达在间作和氰化物处理的花生根系很高(图2 e, f)。水培试验的结果与之类似。由此证明来自邻近的木薯的氰化物激活了花生ET的生产。较高的ET使植物在恶劣的条件下将更多资源投入繁殖，异种邻居的存在以牺牲植物生物量为代价使花生种子产量最大化(表1)。
3. 乙烯通过化学反应调节根际微生物的多样性和组成（田间试验及土培试验）
图3.田间和乙烯添加体系中土壤微生物群α-多样性。a、b 土壤微生物菌群Shannon和Chao 1在木薯和花生根际、相应块状土壤的指数。c, d为不同ET浓度处理下的微生物群Shannon和Chao 1指标。e, f .田间和ET处理中微生物组成的门级分布。
图4基于Bray-Curtis距离的田间和乙烯添加培养样品间加权UniFrac值的主坐标分析(PCoA)。a.PCoA测定田间细菌群落组成。b.根据PCoA，田间细菌群落的优势OUT（相对丰度>0.1%）得分。c. PCoA添加ET处理的细菌群落组成。d.根据PCoA, ET添加处理中细菌群落的优势OTU（相对丰度>0.1%）得分。箭头表示约束因子的质心。圆的大小代表细菌的相对丰度，不同的颜色代表不同的门。
产量升高一般与土壤养分大量消耗有关，但间作花生根际养分高于单作，可能是微生物发挥有机质矿化作用。木薯根际中，微生物Shannon和Chao 1指数最低(P ＜0.05) (Fig. 3a, b),据报道高浓度的氰化物对微生物有毒；而间作花生根际α-多样性比土壤高(图.3a, b)，这可能与植物次生代谢物有关。
为了查明ET浓度改变能否直接改变根际微生物α-多样性,土壤培养结果显示。与未经处理的控制相比,在0.1 - 0.2mM浓度水平的乙烯可以显著增加根际细菌α-多样性 (图3 c, d)。在间作和单作系统中，花生根际只有放线菌Actinobacteria和酸杆菌Acidobacteria的丰度有显著差异；外源乙烯的添加也显示相同结果(Fig.3f)。之前就有研究表明，水杨酸(SA)影响拟南芥根菌群的组成，导致酸杆菌的减少，放线菌的富集。与SA类似，乙烯具有改变植物根系微生物群落组装的潜力，进而可能反馈到植物表型性状如图4，PRi和PRm的群落组成差异主要是酸杆菌的减少(图4b)。这与乙烯添加实验中的结果一致，0.1mM和0.2mM 下酸杆菌被放线菌取代 (Fig. 4c, d)。前人研究表明，许多放线菌都有利用乙烯(ET)作为碳代谢源的潜力。
4.乙烯通过对特定微生物类群的作用来调节根际网络
随机矩阵理论(RMT)构建共现网络。植物根际组合(CRi、PRi和PRm)与块状土壤相比，虽然节点少，但节点之间连接更多(表2)。此外，PRi和PRm的正连接与负连接之比 (表2)显示间作花生根际的连接更具竞争性或抑制性。在木薯、间作花生和单作花生根际样品中，分别鉴定了与Dokdonella独岛菌属(γ-变形菌OTU1, H1) Catenulispora链球菌属(放线菌OTU235，H2)和Pseudolabrys 假单胞菌(α-变形菌OTU73, H3) 有关的细菌模块中心(表3)。在间作花生根际中，Catenulispora sp. 链球菌取代Pseudolabrys sp. 假单胞菌作为关键分类单元，并且与网络中的其他分类单元呈现出更多的负相关关系(表3)。已知链球菌可产生酸性细菌抑制剂，一定程度上可解释间作花生根际酸杆菌丰度的下降。
使用指示剂种类分析来识别具体与乙烯添加相关的OUT。间作花生根际网络中的关键分类单元，OTU235 (Catenulispora sp.)，是0.2 mM乙烯(ET)处理出现的放线菌指标的指标分类单元。此外，土壤铵态氮(NH4+-N)和有效磷(AP)浓度增加 (Fig. 6c, d)。这可能是由于重新组装的微生物群落对土壤磷(酸性磷酸酶活性指数)和有机氮(脲酶活性和l -谷氨酸酶活性指数)矿化作用的积极影响(补充图S5)。
5.土壤性质、植物性状和根际微生物群落对花生生产的影响
图7 a.基于随机森林分析的与植物适应性相关因素的均值预测重要性。b.利用结构方程模型(SEM)研究乙烯排放对制种的直接和间接影响。蓝色和红色箭头分别表示正、负关系，虚线箭头表示非显著路径。箭头旁边的数字是标准化的路径系数，路径宽度表示重要的标准化的路径系数的强度。第一主坐标(PCoA1解释变异的59.3%)被用来代表细菌β-diversity的构成。ET:乙烯排放等;Bio：植物生物量;KRA：关键分类单元相对丰度; avgK：平均网络连通性; β-div：细菌β-多样性;SOC:土壤有机碳;TN:土壤全氮;AP:土壤有效磷。
调查潜在的影响花生种子产量的重要预测因素, 对土壤性质(TN、SOC、AP和pH)、植物性状(乙烯排放和植物生物量)和细菌群落(β-diversity、关键分类单元的相对丰度和平均网络连接)进行了随机森林建模。模型表明,种子生产的最重要的预测因素是平均网络连接,其次是细菌β-diversity、乙烯(ET)分泌,关键分类单元的相对丰度,SOC, TN、植物生物量和AP (P ＜0.05) (图. 7a).土壤pH值对植物种子产量无影响(P = 0.33)(图7a)。然后，我们使用结构方程模型(SEM)来确定土壤特性、植物性状和微生物群落对种子产量的潜在直接和间接影响(图7b)。土壤性质、乙烯(ET)产量和花生生物量与花生种子产量呈正相关(P ＜0.01)。虽然乙烯略微减少了植物的生物量,但它通过影响关键物种的丰度来调节微生物群落结构(P ＜0.01).结果表明，微生物的重新组装与土壤性质直接正相关(P ＜0.001)，说明微生物群落重建确实有利于养分矿化(图7b)。
结论
关键物种在细菌群落的生态功能中起着控制者的作用。当检测到邻居的氰化物时，花生中的根乙烯会直接影响控制者的丰度，从而导致花生根际微生物群的群落组成发生巨大变化，并可能通过增加根际可利用营养物质的积累而进一步增加种子产量。这一发现为开发利用植物激素信号定向调控根际微生物群落的新型间作策略提供了一个有希望的方向。